NMR

Obrazowanie metodą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) to technika spektroskopowa, której można użyć w celu poznania strukturalnych i dynamicznych właściwości cząstek poprzez zbadanie zachowania pewnych atomów po umieszczeniu ich pomiędzy bardzo silnymi magnesami nadprzewodzącymi (180 000 do 360 000 razy silniejszymi niż pole magnetyczne ziemi w przypadku magnesów znajdujących się w UConn Health). Kiedy aktywne w NMR jądra zostaną umieszczone w silnym polu magnetycznym, jądra wyrównują się względem pola i rozpoczynają przetwarzanie z częstotliwością zależną od współczynnika giromagnetycznego izotopów i natężenia przyłożonego pola magnetycznego obok chemicznego i fizycznego środowiska atomu. Komponent częstotliwości, który jest zależny od środowiska chemicznego i fizycznego jest nazywany przesunięciem chemicznym. Eksperymenty NMR zaburzają ustawienie poprzez przyłożenie krótkich impulsów energii o częstotliwości radiowej (RF) w celu ustalenia przesunięcia chemicznego każdego z aktywnych w NMR atomów badanej cząsteczki. Dzięki zastosowaniu kombinacji impulsów i opóźnień (znanych jako sekwencja impulsów) można uzyskać dodatkowe informacje, takie jak które atomy są ze sobą związane i które atomy są przestrzennie ustawione blisko siebie. Wykorzystując wiele różnych eksperymentów, można ustalić trójwymiarową strukturę cząsteczek, w tym dużych biocząsteczek, takich jak białka.

Badania NMR w wysokiej rozdzielczości są bardziej użyteczne w przypadku białek o masie poniżej mniej więcej 25 kDa i rozpuszczalnych do mniej więcej 0,5 mM. W pewnych przypadkach może istnieć możliwość badania białek lub kompleksów większych lub o mniejszej rozpuszczalności. Białka błonowe sprawiają trudności w badaniu z użyciem metod o wysokiej rozdzielczości, ale pojawiają się nowe techniki, które mogą sprawdzić się w tym przypadku. Ponieważ badania NMR wymagają zazwyczaj znakowania, dostępne musi być białko ze stabilnym izotopem 15N, 13C i, czasami, 2H (system ekspresji odpowiedni do wzrostu w wyznakowanej pożywce). Białka muszą zostać oczyszczone (zazwyczaj wymagany jest poziom > 95%), pofałdowane i co najmniej marginalnie stabilne. Zalecana jest wstępna charakterystyka za pomocą dichroizmu kołowego oraz denaturacji termicznej lub chemicznej.

Odpowiedź na to pytanie jest trudna, ponieważ zależy to od postawionych pytań i zachowania próbki. Zazwyczaj potrzeba od 300 µl (ze specjalnymi probówkami NMR) do 600 µl próbki. Stężenia białek w dobrze zachowujących się systemach powinny być wyższe niż 150 µM w przypadku badań strukturalnych, jednakże w badaniach niestrukturalnych można użyć niższych stężeń. Podczas gdy 150 µM to zgrubny szacunek najniższego stężenia w przypadku badań strukturalnych, zaleca się, aby stężenia białek były jak najwyższe, przy czym powinny one być ograniczone rozpuszczalnością i zachowaniem białka, a nie ilością przygotowanego białka. Czas niezbędny do przeprowadzenia dłuższych eksperymentów w celu skompensowania niższych stężeń oraz wydłużony czas potrzebny na interpretację widm NMR będzie niemal pewnie dłuższy niż czas potrzebny na przygotowanie dodatkowej próbki.

Po odpowiednim oczyszczeniu i wysuszeniu próbki kolejnym etapem jest wybór odpowiedniego rozpuszczalnika. Ponieważ deuter jest jak dotąd najbardziej popularnym jądrem blokującym, próbka jest zazwyczaj rozpuszczana w rozpuszczalniku deuteryzowanym (rozpuszczalnik deuteryzowany to taki, w którym w dużej części, zazwyczaj ponad 99%, atomy wodoru zostały zastąpione deuterem). Często stosowanymi rozpuszczalniki deuteryzowanymi są: aceton-d6, benzen-d6 i chloroform-d, chociaż dostępnych jest wiele innych rozpuszczalników.

Czynniki, które należy uwzględnić przy wyborze rozpuszczalnika to:

1. Rozpuszczalność:

• Co oczywiste, im bardziej rozpuszczalna próbka, tym lepiej. Maksymalizuje to ilość próbki w objętości czułej, co zwiększa czułość eksperymentu. Duża rozpuszczalność jest szczególnie ważna, jeśli dostępne są tylko niewielkie ilości próbki.

2. Zakłócenia sygnałów rozpuszczalnika z widmem próbki

• Sam rozpuszczalnik w sposób nieunikniony generuje sygnały NMR, które przesłaniają obszary widma. Te piki pozostałości rozpuszczalnika powinny pokrywać się z sygnałami z próbki.

3. Zależność od temperatury:

• W przypadku eksperymentów wykonywanych w temperaturze pokojowej lub niższych ważnymi czynnikami jest również temperatura topnienia i wrzenia rozpuszczalnika. Ponadto rozpuszczalność próbki prawdopodobnie zmienia się w zależności od temperatury.

4. Lepkość:

• Im niższa lepkość rozpuszczalnika, tym lepsza rozdzielczość eksperymentu.

5. Koszt:

• Co oczywiste w przypadku rutynowych analiz metodą NMR, kiedy zachodzi konieczność pomiaru wielu próbek, koszt rozpuszczalnika jest również ważną kwestią. Co do zasady, cena wzrasta wraz z liczbą deuteryzowanych atomów.

6. Zawartość wody:

• Prawie wszystkie rozpuszczalniki NMR zawierają śladowe ilości wody. Ponadto wiele z nich jest higroskopowych (pochlania wodę z powietrza) i stąd im dłużej są one przechowywane, tym więcej zawierają wody. Obecność piku wody (HDO) jedynie pogorszy jakość widma NMR. Stężenie wody w rozpuszczalniku można znacząco ograniczyć dzięki filtracji przez środek osuszający lub przechowywaniu rozpuszczalnika na sitach molekularnych.
• Wybór rozpuszczalnika dla konkretnej próbki polega na kompromisie pomiędzy zaletami i wadami każdego z nich. Szczegóły dotyczące konkretnego rozpuszczalnika można znaleźć w standardowych informacjach na temat NMR.